პოლიმერაზული ჯაჭვური რეაქციის (PCR) რეაქციის რომელიმე კომპონენტის ადაპტირება შეიძლება შედეგების ხარისხში შეცვალოს პროდუქტის გამოსავლიანობის ან ხარისხის გაუმჯობესების ან შემცირებით ან რეაქციის სპეციფიკისა და მგრძნობელობის გაუმჯობესებით. საბოლოო შედეგებზე გავლენის მქონე პარამეტრებს შეიძლება ჰქონდეთ ფიზიკური (ანუ ტემპერატურა, ციკლის დრო) ან ქიმიური (ანუ თარგი კონცენტრაცია, გამოყენებული ფერმენტის ტიპი). ქვემოთ მოცემულია რამდენიმე ძირითადი ფაქტორი, რომლებიც გავლენას ახდენენ PCR- ის წარმატებაზე.
01 სუფთა ლაბორატორიული პირობები
მას შემდეგ, რაც PCR- ს შეუძლია დნმ-ის ერთ მოლეკულას გამოვლენის უნარი, მნიშვნელოვანია ლაბორატორიებში ხელუხლებელი პირობების შენარჩუნება. ყოველთვის აცვიათ ახალი ხელთათმანები, გამოიყენეთ სტერილური მინის, მილები და პიპეტის რჩევები და სტერილური გადაწყვეტილებები და მუშაობის დაწყებამდე სამუშაოს დაწყებამდე გაწმენდა.
ყოველთვის მოიცავს საკონტროლო რეაქციებს, თარგის დნმ-ს გარეშე და ფერმენტის გარეშე, რათა უზრუნველყონ შედეგები სწორი ნიმუშის გაძლიერების გამო.
ადამიანების უმეტესობა დარწმუნებულია, რომ საკუთარი კომპლექტი გადაწყვეტილებები, რომლებიც არ არის გაზიარებული, რათა troubleshooting ადვილია და დანიშნული პიპეტები ხშირად გათვალისწინებულია PCR მხოლოდ. DNase და RNase თავისუფალი PCR მილები, აეროზოლური რეზისტენტული პიპეტი რჩევები და მუშაობს FUME hood ერთად UV მსუბუქი ასევე გზები, რათა მინიმუმამდე პრობლემები.
02 ქიმიური კომპონენტები
- აქვს 18 დან 24 ბაზები
- არ აქვს საშუალო სტრუქტურა (ანუ, თმის ვარცხნილობა)
- დაბალანსებული განაწილება G / C და A / T წყვილი
- არ შეესაბამება ერთმანეთს 3-ფეხით მთავრდება
- აქვს დნობის ტემპერატურა (Tm) დაახლოებით 5-10 გრადუსი Celcius ქვემოთ annealing ტემპერატურა, რომელიც ჩვეულებრივ შორის 55 და 65 გრადუსი Celcius
Tm ორივე პრაიმერი ასევე უნდა იყოს მსგავსი საუკეთესო შედეგები.
03 რეაქციის შენიშვნა: თარგი და პრაიმერები
ოპტიმალური პრაიმერის კონცენტრაციები 0.1 და 0.6 მიკრომილოგრამს შორისაა. თარგების რაოდენობა დამოკიდებულია დნმ-ის ტიპის (ადამიანის, ბაქტერიული, პლაზმის) მიხედვით.
თარგის ძალიან მცირე რაოდენობით, არსებობს სხვა სტრატეგიები, რათა გაუმჯობესდეს შედეგები, როგორც გაიზარდა ციკლის ნომრები ან "ცხელი დაწყების" გამოყენება. ყოველთვის შეამოწმოთ ახალი პრაიმერები დადებითი კონტროლის რეაქციით, დარწმუნდით, რომ ისინი მუშაობენ თქვენი კონკრეტული ექსპერიმენტული პირობებით.
04 რეაქციის შენიშვნა: ფერმენტის აქტიურობა
რეაქციის შერევით MgCl2- ის კონცენტრაცია გავლენას მოახდენს PCR შედეგზე და მნიშვნელოვან როლს შეასრულებს უფრო მყარი რეაქციებით. მაგნიუმის cation ქმნის ხსნად კომპლექსებს dNTPs- ით წარმოქმნის ფაქტობრივ სუბსტრატს, რომელიც პოლიმერაზას ენზიმს აღიარებს.
ოთხივე DNTP- ის თანაბარი რაოდენობა ასევე შეამცირებს პოლიმერაზების შეცდომის მაჩვენებელს. ზოგიერთი დამატებითი პრეპარატები, როგორიცაა ბეტაინი, BSA, სარეცხი საშუალებები, DMSO, გლიცეროლი და პიროფოსფატაზი შეიძლება გავლენას იქონიონ ფერმენტის სპეციფიკის ან რეაქციის ეფექტურობაზე.
05 თერმოციკლეტორის ტიპი
ლაბორატორიული აღჭურვილობის შეძენისას, გაითვალისწინეთ, რომ ზოგიერთი თერმოციკლერი ნაკლებია, ვიდრე სხვები, რომ შეინარჩუნონ ზუსტი, სასურველი ტემპერატურა.
ეს არის ერთ სივრცეში, სადაც იაფია არ დაიხარჯება გრძელვადიან პერსპექტივაში, როდესაც თქვენ ფიქრი რეაქციის წინაშე დგას ან პრაიმერის გამოყენებით, რომელიც საჭიროებს ტემპერატურის ანნეიფის ვიწრო სპექტრს.
თხელი კედლის რეაქციის მილები, რომლებიც იყენებენ თერმოციკლეკერის ზუსტ ბრენდს, იყენებენ რეაქციის ტემპერატურის ოპტიმიზაციას.
06 ციკლი პარამეტრები
გაზრდილი სარგებელი მიიღწევა ყოველ 20 ციკლის გაფართოების დროის გაზრდით, ნაკლებია ფერმენტისთვის კომპენსაციისთვის, რათა გაზარდოს დამატებითი თარგები. ჩვეულებრივ, 40 ციკლზე ნაკლებია საკმარისი იმისათვის, რომ გაამჟღავნოს 10 თხევადი მოლეკულაციის კონცენტრაცია, რომელიც საკმარისად არის საკმარისი იმისათვის, რომ იხილოთ ეტიდიუმის ბრომიდის ფხვნილი აარარუსის გელი .