ცილების სისუფთავის ხარისხი დამოკიდებულია ცილის მიზნობრივად გამოყენებასთან დაკავშირებით.
ზოგიერთი განაცხადისთვის, ნედლი ექსტრაქტი საკმარისია. თუმცა, სხვა მიზნებისათვის, როგორიცაა საკვები და ფარმაცევტული, საჭიროა სიწმინდის მაღალი დონე. ამ მიზნის მისაღწევად გამოიყენება რამდენიმე ცილის გამწმენდი მეთოდი, როგორც წესი, გამოყენებული იქნას საწმენდი საფეხურების რიგით.
თითოეული ცილის გამწმენდი ნაბიჯი, როგორც წესი, იწვევს გარკვეულწილად პროდუქტის დაკარგვას. აქედან გამომდინარე, იდეალური ცილის გამწმენდი სტრატეგია ერთ-ერთია, რომლის მიხედვითაც ყველაზე ნაკლებ საწმენდებში მიღწეულია ნაკლები ნაბიჯები. შერჩევის რომელი ნაბიჯები გამოიყენოს არის დამოკიდებული ზომა, ბრალდებით, solubility და სხვა თვისებები სამიზნე ცილის. შემდეგი მეთოდები ერთობ ციტოზოლის ცილის გასაწმენდად. ციტოზოლიური ცილების კომპლექსის გაწმენდა უფრო გართულებულია და, როგორც წესი, მოითხოვს სხვადასხვა მეთოდების გამოყენებას.
პირველი ნაბიჯი ცილების გაწმენდისათვის
პირველი ნაბიჯი უჯრედში (უჯრედის შიგნით) ცილების გასაწმენდად არის ნედლი ექსტრაქტის მომზადება .
ამონაწერი შეიცავს ცილების ციტოპლაზმის ყველა ცილის კომპლექსურ ნაზავს და დამატებით მაკრომოლეკულებს, კოფექტურებს და ნუტრიენტებით. ნედლეული ექსტრაქტი შეიძლება გამოყენებულ იქნას ბიოტექნოლოგიის ზოგიერთ განაცხადზე, თუმცა, თუ სისუფთავე არის საკითხი, შემდგომი გაწმენდის ნაბიჯები უნდა მოყვეს.
უჟანგავი ცილის ექსტრაქტები მომზადებულია უჯრედის ლიფის გენერირებული უჯრედების ნამსხვრევების მოცილებით, რომლებიც მიღწეულია ქიმიკატებისა და ფერმენტების , sonication ან ფრანგული პრესის გამოყენებით. ნამსხვრევები ამოღებულია ცენტრიფუგაციით და სუნთქვა ამოღებულია. უჯრედული პროტეინების ნედლეული პრეპარატები შეიძლება მიღებულ იქნას უჯრედების მოხსნაში მხოლოდ ცენტრიფუგაციით.
გარკვეული ბიოტექნოლოგიის გამოყენებისთვის საჭიროა თერმომედეგი ფერმენტების მოთხოვნილება : ფერმენტები, რომლებსაც შეუძლიათ შეაჩერონ მაღალ ტემპერატურაზე უარყოფის გარეშე და მაღალ კონკრეტული საქმიანობის შენარჩუნებისას. ორგანიზმები, რომლებიც აწარმოებენ მათ უწოდებენ extremophiles. სითბოს რეზისტენტული პროტეინის გაწმენდის მარტივი მიდგომა არის ნარევიდან სხვა პროტეინების დათრგუნვა, შემდეგ კი გაცივების გამოსხივება (რითაც საშუალებას აძლევს თერმოდამრგვალო ფერმენტს რემისიის ან რემისიის შესამცირებლად.
შუალედური გამწმენდი ნაბიჯები
წარსულში ნედლი ექსტრაქტიდან პროტეინის გაწმენდის მეორე საფეხური იყო ნალექების მაღალი ნალექებით (მაგ. მარილის ხსნარი) ნალექებით . ნუკლეინის მჟავები ნედლი ექსტრაქტში შეიძლება ამოღებულ იქნას სტრეპტომიცინის სულფატის ან პროტამინის სულფატით წარმოქმნილი აგრეგატების მიერ.
პროტეინის ნალექები, როგორც წესი, მზადდება ამონიუმის სულფატით, როგორც მარილი.
სხვადასხვა პროტეინები აძლიერებს ამონიუმის სულფატების სხვადასხვა კონცენტრაციებს. ზოგადად, მაღალი მოლეკულური წონის პროტეინებს აძლიერებენ ამონიუმის სულფატის ქვედა კონცენტრაციებში. მარილი ნალექები ჩვეულებრივ უდიდეს გაწმენდილი ცილებისკენ მიდის, მაგრამ ხელს უწყობს არასასურველი ცილების აღმოსაფხვრელად ნარევი და ნიმუშის კონცენტრაცია. ხსნარში მარილების ამოღება დიალიზის გზით ხდება ფოროვანი ცელულოზის მილის, ფილტრაციის ან გელი გამონაკლის ქრომატოგრაფიის საშუალებით.
თანამედროვე ბიოტექნიკური პროტოკოლები ხშირად სარგებლობენ მრავალ კომერციულად ხელმისაწვდომი კომპლექტით, რომლებიც უზრუნველყოფს სტანდარტული გადაწყვეტილებების მომზადებას. პროტეინის გამწმენდი ხშირად ხორციელდება ფილტრებით და მომზადებული გელი ფილტრაციის სვეტების გამოყენებით. ყველაფერი რაც თქვენ უნდა გააკეთოთ, მიჰყევით ინსტრუქციებს და დაამატეთ სწორი ხსნარის სწორი მოცულობა და დაველოდოთ განსაზღვრულ ხანგრძლივობას დროთა განმავლობაში შეგროვებისას (სვეტის მეორე დასასრული) სუფთა გამოცდის მილებში.
- ქრომატოგრაფიული მეთოდები შეიძლება გამოყენებულ იქნას სკამზე ზედა სვეტების ან ავტომატური HPLC აღჭურვილობით. HPLC- ის დაშლა შეიძლება გაკეთდეს საპირისპირო-ფაზის, იონის-გაცვლის ან ზომა-გამორიცხვა მეთოდებით და დიოდური მასივის ან ლაზერული ტექნოლოგიით გამოვლენილი ნიმუშებით. അഴി
პროტეინის ვიზუალიზაცია და გასუფთავების შეფასება
- უკუ-ფაზის ქრომატოგრაფია (RPC) ჰყოფს პროტეინებს მათი ნათესავი ჰიდროფობიით . ეს ტექნიკა ძალიან შერჩევითია, მაგრამ მოითხოვს ორგანული გამხსნელების გამოყენებას. ზოგიერთი პროტეინი მუდმივად დენომინირებულია გამხსნელებით და დაკარგავს ფუნქციებს RPC- ში. ამიტომ ეს მეთოდი არ არის რეკომენდებული ყველა განაცხადისთვის, განსაკუთრებით მაშინ, თუკი საჭიროა მიზანშეწონილი პროტეინის შენარჩუნების მიზნით.
- Ion- ის გაცვლა ქრომატოგრაფია ეხება პროტეინების გამოყოფის ბრალდებით . Columns შეიძლება მომზადდეს ანონიმური გაცვლის ან cation გაცვლაზე. Anion გაცვლითი სვეტების შეიცავს სტაციონარული ფაზა დადებითი ბრალი, რომელიც იზიდავს უარყოფითად ბრალი ცილები. Cation გაცვლითი სვეტები არიან საპირისპირო, ნეგატიურად დამუხტული მძივები, რომლებიც დადებითად იზიანებენ ცილებს. სამიზნე პროტეინის (ები) ტუბერკულოზის შეცვლა ხდება პანში სვეტის შეცვლით, რის შედეგადაც ხდება თითოეული ცილის ბრალი ფუნქციური ჯგუფების ცვლილება ან ნეიტრალიზაცია.
- ზომა-გამორიცხვა ქრომატოგრაფია ( გელი ფილტრაცია ) მცირე ზომის პროტეინებს ჰყოფს, ვინაიდან უფრო დიდი მოლეკულები მოგზაურობენ გამრავლების პოლიმერის მეშვეობით ქრომატოგრაფიის სვეტში. მსხვილი პროტეინები არ შეესაბამება პოლიმორის პორებს, ხოლო პატარა პროტეინებს აკეთებენ და უფრო ხანგრძლივად იღებენ ქრომატოგრაფიის სვეტის მეშვეობით, მათი პირდაპირი მარშრუტით. ელეუტი აგროვებს ცილების რიგებში და ამცირებს პროტეინებს ელვის დროს. ლარი ფილტრაცია სასარგებლო საშუალებაა პროტეინის ნიმუშის კონცენტრაციისათვის, რადგან სამიზნე ცილის შემადგენლობაში შეტანილი უმნიშვნელოვანესი ცილა შეგროვდება, ვიდრე თავდაპირველად სვეტში შედის. მსგავსი ფილტრაციის ტექნიკა შეიძლება გამოყენებულ იქნას ფართომასშტაბიანი ცილის წარმოების დროს მათი ეფექტურობის გამო.
- Affinity ქრომატოგრაფია არის ძალიან სასარგებლო ტექნიკა "გაპრიალების" ან დასრულების ცილის გამწმენდი პროცესი. მძივები ქრომატოგრაფიის სვეტში არის ჯვარედინი დაკავშირებული ლიგადების, რომლებიც სავალდებულოა კონკრეტულად სამიზნე ცილა. ცილის შემდეგ ამოღებულია ცილა გამრეცხით, რომელიც შეიცავს უფასო ლიგებს. ეს მეთოდი აძლევს სუფთა შედეგებს და მაღალ სპეციფიკურ საქმიანობას სხვა ტექნიკებთან შედარებით.
- SDS-PAGE არის პოლიაზრილამდე გელი ელექტროფორეზი, რომელიც შესრულებულია SDS (ნატრიუმის დოდიცილ სულფატის) თანდასწრებით, რომელიც აძლიერებს პროტეინებს და აწვდის მათ ქსელში ნეგატიურ ბრალდებას. მას შემდეგ, რაც ბრალი ყველა ცილების სამართლიანად თანაბარი, ეს მეთოდი ჰყოფს მათ თითქმის მთლიანად საფუძველზე ზომა. SDS-PAGE ხშირად იყენებენ პროტეინის სიწმინდის შესამოწმებლად ყოველი ნაბიჯის შემდეგ. არასასურველი პროტეინები თანდათანობით ამოღებულ ნარევიდან გამოიყოფა, SDS-PAGE ლარზე ვიზუალიზებული ზოლების რაოდენობა მცირდება, სანამ არ არსებობს მხოლოდ ერთი ბენდი, რომელიც წარმოადგენს სასურველ ცილებს.
- Immunoblotting არის პროტეინის ვიზუალიზაციის ტექნიკა, რომელიც გამოიყენება აკავშირებს ქრომატოგრაფიასთან. ანტისხეულები სპეციფიკური ცილებისთვის გამოიყენება ligands როგორც affinity ქრომატოგრაფიის სვეტი. სამიზნე ცილა შეინარჩუნებს სვეტს, შემდეგ ამოღებულ სვეტს მარილის ხსნარით ან სხვა აგენტებით. ანტისხეულები, რომლებიც უკავშირდებიან რადიოაქტიურ ან საღებავ ეტიკეტებს, სამიზნე პროტეინის გამოვლენისას, მას შემდეგ, რაც დანარჩენი ნარევიდან გამოყოფილია.
წყაროები:
ზუბა გ. 1988. ბიოქიმია, მე -2 გამოცემა. მაკმილანის გამომცემლობა, ნიუ-იორკი, ნიუ-იორკი, აშშ.
Amersham Pharmacia Biotech. 1999. პროტეინის გამწმენდი სახელმძღვანელო, გამოცემა AB. Amersham Pharmacia Biotech Inc. ნიუ ჯერსი, აშშ. http://www.biochem.uiowa.edu/donelson/Database%20items/protein_purification_handbook.pdf.