რა PCR უნდა გააკეთოს დნმ-ის თანმიმდევრულობისა და გენების გასაძლიერებლად
პოლიმერაზული ჯაჭვური რეაქცია ( PCR ) არის მოლეკულური გენეტიკური ტექნიკა გენის მრავალჯერადი ასლების შესაქმნელად და ასევე გენი სეგმენციის პროცესის ნაწილი.
როგორ მუშაობს პოლიმერაზული ჯაჭვური რეაქცია?
გენური ასლები დამზადებულია დნმ-ის ნიმუშის გამოყენებით და ტექნოლოგია საკმარისია იმისთვის, რომ ნიმუშში ნაპოვნი გენის ერთი ასლიდან მრავალი ასლი მიიღოს. გრანტის გაძლიერება გენის მილიონზე მეტ ასლებს, იძლევა გენური სეგმენტების გამოვლენას და იდენტიფიცირებას ვიზუალური მეთოდების გამოყენებით დნმ-ის ნაწილის ზომისა და ბრალდებით (+ ან -) საფუძველზე.
კონტროლირებად პირობებში, დნმ-ის მცირე სეგმენტებს წარმოქმნიან ფერმენტები დნმ-ის პოლიმერებისაგან, რომლებიც დაამატეთ კომპონენტურ დექსონუკლეოტიდებს (DNTPs) დნმ-ის ნაწილად, რომელიც ცნობილია როგორც "თარგი". დნმ-ის პატარა ნაწილსაც კი, რომელსაც "პრაიმერები" უწოდებენ, პოლიმერაზას ამოსავალი წერტილია. Primers არის პატარა ადამიანის მიერ დამზადებული დნმ (oligomers), ჩვეულებრივ შორის 15 და 30 nucleotides ხანგრძლივი. ისინი მზადდება იდენტიფიცირებული გენიდან გამომდინარე, DNA sequences- ს იცის ან იციან. PCR- ს დროს, დნმ-ის რიგითობა მწვავეა და ორმაგი ფენა ცალკეა. გაგრილების შემდეგ, პრაიმერები აკმაყოფილებენ თარმებს (ე.წ. ანეილინგი) და ქმნიან ადგილს პოლიმერაზას დასაწყებად.
PCR ტექნიკა
პოლიმერაზული ჯაჭვური რეაქცია (PCR) შესაძლებელი გახდა თერმოფილებისა და თერმოფილური პოლიმერაზული ენზიმების აღმოჩენაზე (ფერმენტები, რომლებიც შეინარჩუნებენ სტრუქტურულ მთლიანობასა და ფუნქციონალობას მაღალ ტემპერატურაზე გათბობის შემდეგ).
PCR ტექნიკაში ჩართული ნაბიჯებია:
- ნარევი იქმნება დნმ-ის შაბლონის ოპტიმიზირებული კონცენტრაციით, პოლიმერაზის ფერმენტის, პრაიმერისა და დნტპების. ნემსით სითხის უარყოფის გარეშე, დნმ-ის ნიმუშის ორმაგი ჰელიქსის დესტაბილირება საშუალებას იძლევა, რომ ტემპერატურა 94 გრადუსს აღწევს.
- დეინტრაციის შემდეგ, ნიმუში გაცივდა უფრო ზომიერ დიაპაზონს, დაახლოებით 54 გრადუსი, რაც ხელს უწყობს პირველადი მოხმარების დინამიკას დნმ შაბლონებს.
- ციკლის მესამე საფეხურზე ნიმუში განისაზღვრება 72 გრადუსზე, იდეალური ტემპერატურა Taq დნმ პოლიმერაზასთვის, დრეკადობისთვის. დნმ პოლიმერაზა იყენებს დნმ-ის თავდაპირველ მარყუჟს, როგორც შაბლონს, დაამატებთ დამატებით DNTP- ს, თითოეული პრიმირის 3 "შაბათს და ქმნის ორმაგი Stranded DNA- ს განყოფილებას გენის რეგიონში.
- პრიმერები, რომლებიც დნმ-ს თანმიმდევრობას არ ემორჩილებოდნენ, რომლებიც არ არიან ზუსტი მატჩები, 72 გრადუსზე არ რჩებიან, რაც გულისხმობს ინტერესთა გენის სიგრძეს.
ეს პროცესი denaturing, annealing და elongation მეორდება მრავალჯერადი (30-40) ჯერ, რითაც იზრდება exponentially რაოდენობის ასლები სასურველი გენი ნარევი. მიუხედავად იმისა, რომ ეს პროცესი საკმაოდ მოსახერხებელია, თუ შესრულებულია ხელით, ნიმუშები შეიძლება მომზადდეს და დაიხარჯოს პროგრამირულ თერმოციკლეკერში, ახლა უმეტესად მოლეკულური ლაბორატორიებში გავრცელებულია და სრულ PCR რეაქცია 3-4 საათში შეიძლება შესრულდეს.
ყოველი დენტაციური ნაბიჯი წინა ციკლის დრეკადობის პროცესს აჩერებს, რითაც დნმ-ის ახალ ფენას დაქვეითდება და სასურველი გენის ზომაზე.
გრძელვადიანი ციკლის ხანგრძლივობა შეიძლება უფრო გრძელი ან მოკლეა, რაც დამოკიდებულია ინტერესი გენის ზომაზე, მაგრამ საბოლოოდ, PCR- ის განმეორებითი ციკლის მეშვეობით, თარგების უმრავლესობა შემოიფარგლება მხოლოდ ინტერესი გენის ზომაზე, რადგან ისინი ორივე პრემიერის პროდუქტიდან გამომუშავდება.
წარმატებული PCR- ისთვის არსებობს რამდენიმე განსხვავებული ფაქტორი, რომელიც შეიძლება მანიპულირება შედეგების გასაძლიერებლად. ყველაზე ფართოდ გამოყენებული მეთოდი PCR პროდუქტის არსებობის შესამოწმებლად არის აგარას გელი ელექტროფორეზი . რომელიც გამოიყენება დნმ-ს ფრაგმენტების გამოყოფისა და ზომის მიხედვით. ფრაგმენტები მაშინ გამოიყურება საღებავების ან რადიოიზოტოპების გამოყენებით.
ევოლუცია
მას შემდეგ, რაც აღმოჩენის PCR, დნმ polymerases გარდა ორიგინალური Taq აღმოაჩინეს. ზოგიერთ მათგანს აქვს უკეთესი "დამადასტურებელი" უნარი ან უფრო სტაბილურია უფრო მაღალ ტემპერატურაზე, რაც ხელს შეუწყობს PCR- ს სპეციფიკის გაუმჯობესებას და არასწორი DNTP- ის დანერგვის შეცდომების შემცირებას.
PCR- ის ზოგიერთი ვარიაცია შემუშავებულია კონკრეტული პროგრამებისთვის და ახლა რეგულარულად გამოიყენება მოლეკულურ გენეტიკურ ლაბორატორიებში. ზოგიერთი მათგანი რეალურ დროში PCR და უკუ-ტრანსკრიპტირება PCR. PCR- ის აღმოჩენა ასევე დნმ-ის თანმიმდევრულობის, დნმ-ის თითის ანაბეჭდის და სხვა მოლეკულური ტექნიკის განვითარებას უწყობს ხელს.