დნმ-ის თანმიმდევრული დამოკიდებულება ასევე დამოკიდებულია გელ ელექტროფორეზის გამოყენებისას დნმ-ის ფენების განცალკევებისთვის, რომლებიც განსხვავდება ზომაში, როგორც პატარა, როგორც ერთი ბაზის წყვილი.
დნმ ჩამოყალიბება
1970-იანი წლების ბოლოს აღმოჩენილი იქნა დნმ-ის მოლეკულების ორი დნმ-ის განმსაზღვრელი ტექნიკა. ეს იყო საფეხური (ან დიდიოქსი) და Maxam-Gilbert (ქიმიური სუფთა) მეთოდი. Maxam-Gilbert მეთოდი დაფუძნებულია nucleotide- ს სპეციფიკურ ფხვნილებში ქიმიკატების მიერ და საუკეთესოდ გამოიყენება ოლიგონუკლეოიდების თანმიმდევრობით (მოკლე nucleotide პოლიმერები, როგორც წესი, 50 ბაზისურ წყვილებზე ნაკლები). საანგარიშო მეთოდი უფრო ფართოდ გამოიყენება, რადგან ტექნიკურად უფრო ადვილად გამოსაყენებელია PCR- ისა და ტექნიკის ავტომატიზაციის საშუალებით, ადვილად მიმართავენ DNA- ს გრძელ ფენას, მათ შორის მთელი გენი. ეს მეთოდი დაფუძნებულია ჯაჭვის შეწყვეტაზე dideoxynucleotides დროს PCR დრეკადობის რეაქციები.
საანგარიშო მეთოდი
შპრიცის მეთოდის გამოყენებით დნმ-ის ანალიზი განიხილება, როგორც თარგი და დნმ-ის პოლიმერაზა გამოიყენება PCR- ის რეაქციაში, რათა პრაიმერის გამოყენებით კომპლიმენტური ფენების გენერირება.
მომზადებულია ოთხი განსხვავებული PCR რეაქციის ნარევები, რომელთაგან თითოეული შეიცავს dideoxynucleoside triphosphate (ddNTP) ანალოგებს ერთ-ერთი ოთხი ნუკლეოტიდის (ATP, CTP, GTP ან TTP) გარკვეულ პროცენტებში. ახალი დნმ-ის სიგრძის სინთეზი გრძელდება მანამ, სანამ ერთ-ერთი ასეთი ანალოგი არ არის ჩართული, რომლის დროსაც ნაკაწრები ნაადრევად ხრწნიან.
თითოეული PCR რეაქცია დასრულდება დნმ-ის სხვადასხვა სიგრძის ნარევი შემცველი ნაქსოვი, რომელიც დასრულდა ნუკლეოტიდით, რომელიც ამ რეაქციისთვის ე.წ. გელ ელექტროფორეზს შემდეგ ოთხი რეაქციის ფენა გამოყოფს, ოთხი ცალკე ბილიკებში და განსაზღვრავს ორიგინალური შაბლონის თანმიმდევრობას, თუ რა სიგრძის ფენების სიგრძეა ნუკლეოტიდის დასრულებამდე.
In ავტომატური Sanger რეაქცია, პრაიმერები გამოიყენება, რომლებიც შეაფასა ოთხი სხვადასხვა ფერადი fluorescent tags. PCR რეაქციები, სხვადასხვა dideoxy nucleotides თანდასწრებით, შესრულებულია ზემოთ აღწერილი. თუმცა, შემდეგი, ოთხი რეაქცია ნარევები შემდეგ კომბინირებული და მიმართა ერთი ჩიხი ლარი. თითოეული ფრაგმენტის ფერი გამოვლენილია ლაზერული სხივის გამოყენებით და ინფორმაციის შეგროვება ხდება კომპიუტერის მიერ, რომელიც ქმნის ქრომატოგრამებს, რომლებიც ასახავს თითოეული ფერის პიკს, საიდანაც შეიძლება განისაზღვროს შაბლონის დნმ-ის თანმიმდევრობა.
როგორც წესი, ავტომატური თანმიმდევრული მეთოდი ზუსტია მხოლოდ მაქსიმალური დაახლოებით 700-800 ბაზის-წყვილთა სიგრძისთვის. თუმცა, შესაძლებელია უფრო დიდი გენების სრული თანმიმდევრობა და, ფაქტობრივად, მთელი გენომები, ისეთი ნაბიჯებიანი მეთოდების გამოყენებით, როგორებიცაა პრაიმერ ვოკინგი და თოფიანი თანმიმდევრობა.
პრაიმერის გასეირნებაში , უფრო დიდი გენის შემადგენელი ნაწილია თანმხლები მეთოდის გამოყენებით. ახალი პრაიმერები წარმოიქმნება თანმიმდევრული ნაწილისაგან და გამოიყენება გენეზის განყოფილების გაგრძელება, რომელიც ორიგინალური რეაქციების ფარგლებს გარეთ იყო.
თოფიანი თანმიმდევრობა იწვევს შემთხვევითი დნმ-ის სეგმენტის ინტერესი უფრო სწორად (მართვადი) ზომის ფრაგმენტებში, თითოეული ფრაგმენტის თანმიმდევრულობად და ცალი კონცენტრაციების საფუძველზე. ეს ტექნიკა გაკეთდა კომპიუტერული პროგრამების გამოყენებით უფრო ადვილად გამოსაყოფად.